mahisa's blog

Just another Blogs de la Universitat de València site

Archive for marzo, 2012


Replicació per cercle rodant:


La síntesi de DNA comença amb un tall específic en l’origen de replicació. L’extrem 5 ‘es desplaça del dúplex, el que permet que l’ADN pol III afegiu dNTP a l’extrem 3’OH. L’extrem 5 ‘és rodat fora com una cua lliure que va incrementant la seva longitud. Aquesta cadena d’un cercle rodant pot ser convertit a DNA dúplex a través de la formació de fragments d’Okazaki que creixen a partir d’encebadors RNA.

http://fbio.uh.cu/sites/genmol/confs/conf4/p5.htm

Replicació:

Per a facilitar la comprensió del proces replicatiu ho explicaré de forma esquemàtica.

1. Les partícules del virus s’adhereixen a les cèl·lules diana mitjançant la unió a les proteines del pilus F G3P d’acollida. La retracció del pilus fa que el virió s’unisca a la membrana interna del hoste.

2. Les proteïnes de la càpsida injecten el nucli de DNA al citoplasma cel·lular.

3. La polimerasa del hoste converteix el genoma (+) ssDNA viral en un tancat covalent-ment dsDNA anomenat en forma replicativa de DNA de RF.

4. Els gens virals són transcrits per la RNA polimerasa d’acollida.

5. La proteina viral g2p obri la cadena de DNA en l’origen de replicació.

6. (+) Es produeix per la replicació de cadena de cercle rodant.

7. Els nous genomes de (+) ssDNA es converteixen en noves molècules de RF, i es produeix la transcripció adicional.

8. Quan la proteina g5p es sintetitzada, la conversió en RF dsDNA s’inhibeix, i el ssDNA genòmic es cobreix amb g5p.

9. Les g5p se substitueixen per les proteïnes G8p per acoblar la càpsida vírica.

10. Els nous virions surten fora de la cèl·lula hoste.

11. Les cèl·lules infectades continuen dividint-se i produeix virions per temps indefinit.

http://viralzone.expasy.org/all_by_species/558.html

Conjugació

Abans de descriure el procés d’infecció de M13 hem de tenir clar el procés de conjugació, ja que, els fags de tipus M13 infecten soques d’E. coli portadores del episoma F ‘. La conjugació consisteix en la unió de dos bactèries de la mateixa o diferent espècie per a la transferència del material genètic. Els bacteris s’uneixen per mitjà d’un pont citoplasmàtic pel qual passa el plasmidi F (plasmidi de conjugació) a la cèl·lula receptora. Aquest procés només es dóna entre un bacteri que contingui el plasmidi (F +) i una altra sense el plasmidi (F-). El plasmidi de conjugació pot integrar-se al cromosoma del bacteri, el que es coneix com Hfr («High Frecuency recombination»).

Recordatori

El genoma del bacteriòfag M13 és circular, de cadena simple de DNA. La replicació és realitza a través de DNA de doble cadena intermitja i de cercle rodant. Cada gen és transcrit per la maquinària cel·lular de l’hoste, a través d’un promotor específic. Alguns gens de l’extrem per un terminador de la transcripció.

http://viralzone.expasy.org/

Cromosomes artificials

Els vectors com M13, o els vectors plasmídics que poden contenir entre 2 i 10 kbp de DNA clonat, són adequats per a elaborar biblioteques gèniques per a la seqüenciació de genomes procariòtics. Els vectors del fag lambda, que poden contenir 20 kbp o més, també són àmpliament utilitzats en els projectes de genòmica. No obstant això, a mesura que la grandària del genoma que es vol seqüenciar augmenta, ho fa el nombre de clons necessaris per obtenir una seqüència completa.

Per tant, per construir biblioteques de DNA d’organismes eucariotes o d’eucariotes superiors, com els humans, és útil comptar amb vectors que puguin contenir segments molt llargs de DNA. Això permet que la grandària de la biblioteca inicial sigui manejable. Aquests vectors s’han desenvolupat i es diuen cromosomes artificials.

“Brock Biología de los Microorganismos”. Madigan, M.T., J.M Martinko, P.V. Dunlap i D.P. Clark. 12ª ed. Pearson. Addison Wesley. 2009. Capítol 12

Ús de M13 en clonació molecular

Per clonar DNA en els vectors M13, s’aïlla DNA replicatiu de doble cadena de l’hoste infectat i es tracta amb un enzim de restricció. El DNA estrany es tracta a continuació amb el mateix enzim de restricció. Amb la lligació s’obtenen molècules de M13 de doble cadena que contenen el DNA estrany. Quan aquestes molècules s’introdueixen en la cèl•lula per transformació, es repliquen i produeixen partícules de bacteriòfag de DNA monocatenari que contenen el DNA clonat.

El DNA monocatenari de M13 produït es pot utilitzar directament per a la seva seqüenciació. Com la seqüència de bases prop del lloc de tall on s’ha inserit el DNA estrany és coneguda, és possible construir un oligonucleòtid encebador complementari a aquesta regió i utilitzar-lo per determinar la seqüència de DNA després d’aquest punt. En aquest sentit, els derivats de M13 han demostrat ser extremadament útils en la seqüenciació de DNA estrany, fins i tot de molècules bastant llargues, i han ocupat un lloc important en la seqüenciació de diversos genomes.

“Brock Biología de los Microorganismos”. Madigan, M.T., J.M Martinko, P.V. Dunlap i D.P. Clark. 12ª ed. Pearson. Addison Wesley. 2009. Capítol 12

Vectors derivats del bacteriòfag M13

M13 és el bacteriòfag filamentós model i ha sigut utilitzat extensament com a vector de clonació i seqüenciació de DNA en enginyeria genètica.

La major part del genoma de M13 està format per gens essencials per a la replicació del virus. No obstant açò, hi ha una petita regió anomenada seqüència intergénica que es pot utilitzar com a lloc de clonació. Es poden clonar fragments de DNA estrany de longituds variables, de fins a 5 kbp, sense afectar a la variabilitat del fag. A mesura que el genoma es fa més gran, simplement el virió creix més.

El fag M13mp18 és un derivat de M13 en el que s’ha modificat la regió intergénica per a facilitar la clonació. Una modificació útil és la inserció d’un fragment funcional de lacZ, el gen de E.coli que codifica l’enzim β-galactosidasa.

Les cèl·lules infectades amb M13mp18 es poden detectar fàcilment pel seu color en plaques indicadores. Açò s’aconsegueix utilitzant el substrat artificial, Xgal, que la β-galactosidasa talla per a obtindre un color blau. El propi gen lacZ s’ha modificat per a contenir un lloc de clonació múltiple de 54bp, que conté alguns llocs de restricció que no s’encontren en el genoma de M13. El lloc de clonació múltiple es inserit en el inici de la porció codificadora del gen lacZ, però no afecta a la seua activitat enzimàtica. En canvi, la inserció de DNA clonat addicional en el lloc de clonació inactiva el gen. Els fags amb aquestes insercions produeixen calbes incolores (sense activitat β-galactosidasa), i per tant són fàcilment identificables.

“Brock Biología de los Microorganismos”. Madigan, M.T., J.M Martinko, P.V. Dunlap i D.P. Clark. 12ª ed. Pearson. Addison Wesley. 2009. Capítol 12